PSEUDOPTEROGORGIA ELISABETHAE DE SAN ANDRÉS Y PROVIDENCIA, UNA PLUMA DE MAR CON EXCELENTE POTENCIAL COMO FUENTE DE PRODUCTOS NATURALES CON APLICACIÓN INDUSTRIAL

Abstract

Pseudopterogorgia elisabethae, una interesante pluma de mar que crece en las islas de San Andrés y Providencia (Caribe Colombiano nor-ocidental), ha sido sujeto de estudios bioprospectivos por nosotros durante los últimos 7 años. En la primera etapa de la investigación se recolectaron fragmentos de colonias individuales en varios sitios y a diferentes profundidades alrededor de las Islas de San Andrés y Providencia. Luego de preparar extractos con CH2 Cl2 /MeOH y de someterlos a Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia acoplada a Espectrometría de Masas se establecieron según la composición mostrada por el perfil cromatográfico dos quimiotipos diferentes para Pseudopterogorgia elisabethae, el quimiotipo 1 para especímenes provenientes de la Isla de Providencia y el quimiotipo 2 para colonias establecidas en la Isla de San Andrés. El quimotipo 1 fué característico y exclusivo de los animales recolectados en Providencia, pero el quimotipo 2 aunque muy abundante en los animales recolectados en San Andrés, ocasionalmente fue encontrado en animales de la Isla de Providencia.

Aplicando métodos cromatográficos, espectroscópicos y de transformaciones químicas a los dos conjuntos de extractos reunidos de cada quimiotipo, se logró establecer que el quimiotipo 1 presentó como constituyentes mayoritarios una mezcla compleja (4-16%) de aproximadamente trece compuestos tipo pseudopterosinas, seco-pseudopterosinas y amfilectosinas. Estos compuestos se aislaron e identificaron como sigue: ocho con estructura no reportada anteriormente, las pseudopterosinas P-S, glicosidadas en el C-10 con L-fucosa libre y acetiladas en los C-4’, C-3’ y C-2’ respectivamente, las pseudopterosinas T-V glicosidadas en el C-10 con D-arabinosa libre y acetiladas en los C-4’ y C-3’, respectivamente y la seco-pseudopterosina K, glicosidada en el C-7 con L-fucosa libre, y cinco de estructura conocida las pseudopterosinas G y K, la seco- pseudopterosina J y las amfilectosinas A y B.

El quimiotipo 2 se caracterizó por tener bajas concentraciones (2-4%) de las mismas pseudopterosinas y seco-pseudopterosinas mencionadas anteriormente, pero en contraste sus constituyentes mayoritarios fueron una mezcla en equilibrio de diterpenos no glicosidados (MEDNG) tipo amfilectano denominados 10-acetoxi-9-hidroxi—amfilecta-8,10,12,14 tetraeno y 9-acetoxi-10-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14 tetraeno, junto con dos componentes minoritarios el elisabetatrienol y la amfilecta-8(13),11,14-trieno-9,10-diona.

Paso seguido los extractos crudos de los dos quimiotipos fueron sometidos a evaluación de sus propiedades antiinflamatorias en bioensayos in vivo usando el modelo clásico de inflamación aguda (edema en oreja de ratón) y la inhibición del mediador de inhibición MPO liberado en el edema formado. Los resultados mostraron para los extractos, bajos niveles de inhibición de la inflamación en el edema auricular comparados con el estándar de indometacina utilizado, en contraste los dos extractos mostraron una marcada inhibición del mediador de inflamación MPO, inclusive superior a la indometacina. Adicionalmente, en el ensayo de inhibición de MPO in vitro, los compuestos MEDNG, PsQ, PsS, PsT y PsU mostraron niveles mas altos de inhibición de la inflamación que los exhibidos por los estándares dexametasona e indometacina. En los ensayos de liberación de NO in vitro, los tratamientos mas potentes fueron los compuestos MEDNG, la PsP y la PsT. Por otro lado las PsQ, PsS y PsU fueron potentes agentes captadores de NO, y como las PsG, PsP y seco-PsK no tuvieron actividad captadora de NO, suponemos que ellos deben estar inhibiendo la sintasa de NO (iNOS) u otras rutas que influencien la producción de esta enzima.

En los estudios de citotoxicidad usando el ensayo de MTT con cinco líneas tumorales: HEp-2 (carcinoma de laringe), MKN-45 (carcinoma de estomago), HT-29 (adenocarcinoma de colon), MCF-7 (adenocarcinoma de mama) y HeLa (carcinoma de cervix) y dos cultivos de fibroblastos normales Fib 04 (epitelio bucal humano) y Fib 05 (tejido de cordón umbilical humano), los resultados mostraron que ambos extractos tanto el del quimiotipo 1 como el del quimiotipo 2, presentaron una actividad citotóxica promisoria sobre las líneas tumorales empleadas, observándose una reducción de la supervivencia en todas las líneas celulares usadas. Sin embargo, el extracto del quimiotipo 1 fue mas potente en citotoxicidad que el del quimiotipo 2.

En los ensayos de actividad antimicrobiana, los resultados demostraron que todas las pseudopterosinas, seco-pseudopterosinas y MEDGN aislados de P. elisabethae, tienen actividad selectiva contra bacterias marinas gram positivas y contra bacterias terrestres patógenas gram positivas (con valores de IC50 entre 1.4 y 17 μg/ml), pero no tienen actividad contra el hongo evaluado.

Finalmente, en los ensayos antifouling realizados (usando organismos representantes del microfouling y del macrofouling) los resultados mostraron que el quimiotipo 1 (fracciones que contienen pseudopterosinas) y las PsQ y U (las demás pseudopterosinas y seco-pseudopterosians aisladas de los ejemplares de Providencia y San Andrés, están aún en fase de valoración) tienen propiedades antifouling en concentraciones promedio de 1 mg/ml contra los organismos ensayados, lo que hace estos compuestos muy atractivos para posteriores valoraciones en campo como agentes ambientalmente amigables.

En conclusión los resultados aquí presentados demuestran que los compuestos aislados de esta pluma de mar P. elisabethae de San Andrés y Providencia son moléculas promisorias con un perfil de actividad antiinflamatoria, citotóxica, antibacteriana y antifouling muy interesante, lo cual hace de este recurso una fuente muy atractiva de compuestos que pueden ser utilizados industrialmente.

Pseudopterogorgia elisabethae, an interesting sea feather found in the islands of San Andrés and Providencia (SW Colombian Caribbean), has been the subject of our research studies for the last 7 years. In the first step of the studies here presented we collected fragments of individual colonies at various sites and depth ranges around the islands. Collected samples were extracted with CH2 Cl2 /MeOH and then subjected to HPLC-MS. Chromatographic profiles of the extracts, allowed us to recognize two different chemotypes for P. elisabethae. Chemotype 1 characterized samples from Providencia whereas chemotype 2 characterized samples from San Andres. Chemotype 1 was characteristic and exclusive of samples collected at Providencia. Chemotype 2 was characteristic but not exclusive to samples collected at San Andres, occasionally was found in samples from Providencia.

Each extract from the both chemotypes was fractionated by chromatographic means and the pure isolated compounds thus obtained were carefully identified by spectroscopic and chemical methods. A complex mixture (4-16%) of 13 compounds (pseudopterosins, seco-pseudopterosins and amphilectosins) characterized chemotype 1. Those were identified as follows: eight new compounds in nature, PsP, Q, R, and S glycosylated at C-10 with free and acetylated at C-4’, C- 3’ and C-2’ L-fucose, respectively, PsT, U and V glycosylated with D-arabinose free and acetylated at C-4’ and C-3’, respectively and the seco-PsK, glycosylated at C-7 with free L-fucose and five known compounds, PsG, K, seco-PsJ and amphilectosins A and B.

Chemotype 2 contained lesser amounts (2-4%) of the compounds mentioned above. In contrast it showed as major constituents an interconverting 1:1 mixture of non glycosylated amphilectane type diterpenes (IMNGD) (10-acetoxi-9-hydroxy-amphilecta-8,10,12,14 tetraene and 9-acetoxy- 10-hydroxy-amphilecta-8,10,12,14 tetraene) and minor amounts of elisabethatrienol and amphilecta- 8(13),11,14-triene-9,10-dione.

Subsequently, the evaluation of the anti-inflamatory properties in vivo of extracts (chemotype 1 and chemotype 2) was carried out by using the TPA-induced ear oedema model, classical experiment of acute inflammation and by inhibiting the MPA mediator released to the oedema tissues. The results showed relatively low levels of inflammation inhibition, when compared to the activity showed by the anti-inflammatory commercial drug indomethacin. In contrast, we found marked inhibition of MPO levels by both extracts, even superior to the inhibition shown by indomethacin. Additionally, in the in vitro MPO assay IMNGD, PsQ, PsS, PsT and PsU exhibited higher levels of inhibition compared with indomethacin and dexamethasone. In the NO release in vitro, IMNGD, PsP and PsT were the most potent treatments. On the other hand, PsQ, PsS and PsU did show NO scavenger activity but PsG, PsP and seco-PsK did not exhibit any scavenger activity. The latter compounds should inhibit the inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) or other routes that influence this enzyme.

The cytotoxicity activity of the compounds isolated from P. elisabethae was studied by the MTT assay, using the following cell lines: HEp-2 (carcinoma of the larynx), MKN-45 (stomach cancer), HT-29 (adenocarcinoma of the colon), MCF-7 (breast cancer) y HeLa (cervix cancer) and two fibroblast culture of normal cells. The results showed that both the chemotype 1 as the chemotype 2 presented promising activity against all cancer cell lines used. However, the extract of chemotype 1 was more potent that of the chemotype 2.

In the antimicrobial assays all pseudopterosins, seco-pseudopterosins and the IMNGD isolated from P. elisabethae exhibited selective activity against marine and pathogenic terrestrial gram positive bacteria (IC50 values between 1.4-17 μg/ml) but they did not show any activity against Candida albicans.

Finally, in regard to the marine antifouling laboratory bioassays used to evaluate the antifouling properties of the compounds isolated during this work from the chemotype 1 of P. elisabethae, against marine organisms representative of micro- and macrofouling, the results showed that the crude extract, fractions containing pseudopterosins, seco-pseudopterosins and amphilectosins, and PsQ and PsU had promising antifouling power in concentrations about 1 μg/ml. The research in this direction still continues in our laboratory.

In conclusion, all results presented here contribute to demonstrate that the compounds isolated from the sea P. elisabethae are promising molecules having an interesting anti-inflamatory, cytotoxyc, antibacterial and antifouling activity profile. This fact makes this marine organism an attractive source of compounds which could be used in the industry.